الدرس 132 : إستنساخ تتابعات الـ DNA

>

إستنساخ تتابعات الـ DNA : 

إنتاج العديد من نُسخْ جين معين ( كجين إنتاج الأنسولين ) أو قطعة من الـ DNA بعد الحصول على تلك القطعة بقصها من شريط DNA مباشرة بواسطة إنزيمات القصر أو بشكل غير مباشر عن طريق عزل M.Rna المنسوخ من هذا الجين أو المنسوخ من تلك القطعة فى الخلية ثم معاملته بإنزيم النسخ العكسى لإنتاج الجين منه مرة ثانية ًبطريقة عكسية ثم يُضاعف هذا الجين بجهاز PCR وإنزيم تاك بوليميريز أو بلصقه ببلازميد وإدخاله فى خلية بكتيرية ( تسمى الحامل أو المضيف ) بهدف تسخير تلك الكائنات لإنتاج مركبات وإنزيمات مرغوبة . 

ملحوظة : 

♦ يتم إستخدام طريقة البلازميد أو الفاچ لأن DNA لو دخل أى جزء منه مباشرة فى الجسم سيتحلل بفعل الإنزيمات وسيتم تحطيمه بسرعة . 

♦ كسر وتكوين الروابط فى جزئ DNA وجزئ RNA : 

♢ تعمل إنزيمات القصر على كسر الروابط التساهمية عند مواقع محددة بين النيوكليوتيدات المتجاورة والهيدروجينية بين القواعد المتكاملة والمتقابلة . 

♢ يعمل إنزيم ديؤكسى ريبونيوكليز على كسر الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتكاملة والمتقابلة والتساهمية بين النيوكليوتيدات المتجاورة بين كل النيوكليوتيدات . 

♢ يعمل إنزيم اللولب على كسر الروابط الهيدروجينية فقط بين القواعد المتكاملة والمتقابلة فى الشريطين . 

♢ يعمل إنزيم بلمرة DNA على تكوين الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتكاملة والمتقابلة فى الشريطين وكذلك تكوين الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات المتجاورة . 

♢ يعمل إنزيم بلمرة RNA على تكوين الروابط التساهمية فقط بين النيوكليوتيدات المتجاورة ( لأن RNA عبارة عن شريط مفرد ) . 

♢ تعمل إنزيمات الربط على تكوين الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات المتجاورة والهيدروجينية بين القواعد المتكاملة والمتقابلة ( فى حالة إصلاحها لعيوب DNA ) 
بينما تعمل على تكوين الروابط التساهمية فقط ( فى حالة ربطها للقطع أثناء تضاعف DNA وفى حالة ربطها للأطراف اللاصقة لنوعين من الـ DNAتم معاملتهما بنفس إنزيم القصر ) . 

♢ تعمل الإنزيمات المعدلة على تكوين روابط تساهمية بين مجموعات الميثيل المضافة والنيوكليوتيدات فى منطقة تعرف إنزيم القصر على جزئ DNA . 

♢ يعمل إنزيم النسخ العكسى على تكوين الروابط التساهمية فقط بين النيوكليوتيدات المتجاورة فى شريط DNA المفرد الناتج . 

♢ يعمل إنزيم تاك بوليميريز على تكوين الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتكاملة والمتقابلة فى الشريطين وكذلك تكوين الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات المتجاورة . 

♦ تكوين الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات المتجاورة يحتاج لإنزيم

 أما تكوين الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتكاملة والمتقابلة قد يحتاج لإنزيم وقد لايحتاج لإنزيم فمجرد تقارب الشريطين أو تبريدهم بعد التسخين تنشأ تلك الروابط . 

♦ كسر الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات المتجاورة يحتاج لإنزيم 

أما كسر الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتكاملة والمتقابلة قد يحتاج لإنزيم وقد لايحتاج لإنزيم فبمجرد تسخين الشريطين تنكسر تلك الروابط . 

♦ عمل إنزيم تاك بوليميريز عكس عمل إنزيم ديؤكسى ريبونيوكليز :

فالأول : يبنى شريطى DNA مزدوج من وحداته البنائية ( نيوكليوتيدات ) ،

والثانى : يحلل ويفصل جزئ DNA المزدوج إلى وحداته البنائية . 

تشتمل تقنية إستنتساخ تتابعات الـ DNA على خطوتين هما : 

( أ ) الحصول على قطع DNA المراد نسخها . 

( ب ) كيفية نسخ تلك القطع ( عملية الإستنساخ ) . 

الطريقة الأولى - ( غير مباشرة )  - ( الأعقد والأصعب ) : 

عن طريق إستخدام إنزيمات القصر  لفصل الجين المطلوب من المحتوى الجينى : 

♢ نفصل كل المحتوى الجينى بالخلية . 

♢ نعزل DNA ( المراد قص جين أو قطعة منه لإستنساخها ) . 

♢ يُعامل DNA المعزول بإنزيمات القصر ( نوع معين منها ) ليتم قص القطعة المطلوبة المعلومة التتابع المرغوب فى التعامل معها . 

♢ فنحصل على ملايين من قطع DNA بأطراف مفردة يمكن لصقها ببلازميدات أو فاج لإستنساخها ( مضاعفتها ) . 

الطريقة الثانية - ( مباشرة ) :

 عن طريق إستخدام إنزيم النسخ العكسى لإنتاج الجين المطلوب : 

♢  نحصل على Mrna الذى يحمل شفرة الجين المراد نسخه والموجود بكثرة فى الخلايا التى يكون فيها الجين الذى نود التعامل معه نشطاً

 فمثلاً : 

- إذا أردنا مضاعفة الجين المسئول عن تكوين هرمون الأنسولين لإنتاج كميات كبيرة من الأنسولين ( بروتين ) نعزل M.Rna ( الذى تم نسخه من هذا الجين النشط داخل خلايا بيتا بجزر لانجرهانز بالبنكرياس والموجود بكثرة فى تلك الخلايا ) والذى يحمل الرسالة اللازمة لبناء هذا الهرمون . 

-- وإذا أردنا مضاعفة الجين المسئول عن تكوين بروتين الهيموجلوبين نعزل M.Rna ( الذى تم نسخه من هذا الجين النشط داخل خلايا نخاع العظام المولدة لكريات الدم الحمراء والموجود بكثرة بتلك الخلايا ) والذى يحمل الرسالة اللازمة لبناء هذا البروتين . 

-- وإذا أردنا مضاعفة الجين المسئول عن تكوين بروتين الكورتيزون نعزل M.Rna ( الذى تم نسخه من هذا الجين النشط داخل خلايا قشرة الغدة الكظرية والموجود بكثرة بتلك الخلايا ) والذى يحمل الرسالة اللازمة لبناء هذا البروتين وهكذا ... 

♢  نستخدم M.Rna المعزول كقالب لبناء شريط DNA مفرد الذى يتكامل معه ( عكس عملية النسخ ) عن طريق معاملته بإنزيم النسخ العكسى .  

♢ نستخدم شريط DNA المفرد المتكون كقالب أيضاً لإنتاج شريط الـ DNA الآخر الذى يتكامل معه

وذلك بمعاملة هذا الشريط المفرد بإنزيم بلمرة DNA وإنزيمات الربط فنحصل على لولب مزدوج من DNA ( شريطين ) يمكن إستنساخه ، وبالتالى نحصل على آلاف النسخ من تلك القطعة أو الجين لدراستها . 

♢  يتم إزالة M.Rna  بتحليله بالإنزيمات . 

ملحوظة : 
⚀ النسخ هو تكوين شريط الـ  RNAوخصوصاً M.Rna من جزء من الـ DNA يسمى جين ) ، أما الإستنساخ فهو تكوين نسخ عديدة من جزء من الـ DNA أو جين .

⚀ طريقة الـ M.Rna أفضل من طريقة الجين بالرغم من أنها أطول فى الخطوات بسبب أن : 

-- M.Rna تم معالجته لإزالة الأجزاء التى لاتمثل شفرة والموجودة على الجين الذى تم نسخه منه . 

-- عدد الجينات فى الجينوم كبيرة جداً يتراوح من 60 إلى 80 ألف جين بينما يزداد عدد M.Rna الخاص بإنتاج بروتين معين فى سيتوبلازم الخلية التى تُنتجه مثل خلايا بيتا بالبنكرياس المفرزة للأنسولين . 

⚀ لاتوجد شفرة إنزيم النسخ العكسى فى كل الكائنات :

وإنما توجد فى الفيروسات التى محتواها الجينى ( مادتها الوراثية كاملة ) عبارة عن RNA مثل فيروس الإيدز ، حتى يمكنها تحويل مادتها الوراثية من RNA إلى DNA مزدوج ( على خطوتين ) بعدما تحقنها وتُدْخِلْها فى سيتوبلازم الخلية العائل التى أصابتها وذلك لأن : 

-- RNA لايستطيع الإرتباط بـ DNA لخلية العائل . 

-- وكذلك بسبب وجود إنزيمات تتعرف على وتحلل RNA فى السيتوبلازم ( لأنه لايملك ذيل من عديد الأدينين ) وعدم وجود إنزيم ديؤكسى ريبونيوكليز فى السيتوبلازم والذى يحلل DNA . 

وبذلك تضمن تضاعف مادتها الوراثية مع تضاعف DNA الخلية العائل . 

⚀ ممكن بعد إرتباط DNA الفيروسى ( الناتج من RNA الفيروسى ) بـ DNA الخلية التى أصابها :

 أن يبقى ساكن وغير نشط لسنوات وعندما ينشط مرة أخرى ينسخ RNA الفيروسى مرة أخرى من DNA الفيروسى وبذلك تضمن تضاعفها . 

⚀ RNA الفيروسى الذى يتم حقنه هو الحامل لشفرة تكوين إنزيم النسخ العكسى  :

وتكوين ذلك الإنزيم هى أول خطوة يبدأ بها الفيروس مع حقن مادته الوراثية قبل أن يتم تحليل تلك المادة بفعل إنزيمات سيتوبلازم الخلية العائل ، ولولا ذلك التحويل فى المادة الوراثية لغابت الأمراض الفيروسية التى تنتج عن تلك الأنواع من الفيروسات . 

⚀ بعد إتمام عملية التحويل من RNA إلى DNA تُحلل إنزيمات السيتوبلازم الشريط الأصلى RNA . 

⚀ شفرة إنزيم النسخ العكسى موجودة على RNA الفيروس :

 ولكن لايستعملها الفيروس إلا وقت الهجوم على خلية لتحويل مادته الوراثية من RNA إلى DNA ، وقتها تترجم إلى بروتين . 

⚀ لووُجد إنزيم ديؤكسى ريبونيوكليز فى سيتوبلازم خلية بكتيرية :
سيتم تحليل DNA البكتيرى لعدم وجود غشاء نووى ، وإذا وُجد ذلك الإنزيم فى سيتوبلازم خلية حقيقية النواة فلن يؤثر على DNA الموجود فى النواة لوجود غشاء نووى حقيقى . 

إنزيم النسخ العكسى : 

هو إنزيم يوجد فى الفيروسات التى تكون شفرتها الوراثية RNA وليس DNA و يستعمله الفيروس وقت الهجوم على خلية لتحويل مادته الوراثية من RNA إلى DNA بسبب أن :

-- RNA الفيروسى لايستطيع الإرتباط والإندماج بـ DNA فى خلية العائل .

-- وكذلك بسبب وجود إنزيمات تحلل الـ RNA فى السيتوبلازم .

 فيعمل ذلك الإنزيم على تركيب أحد شريطى جزئ DNA إنطلاقاً من RNA الفيروسى بمبدأ تكامل القواعد النيتروجينية A-U و C-G ( وتتم تلك الخطوة فى سيتوبلازم خلية العائل ) ،

ثم يدخل الشريط المتكون من السيتوبلازم إلى النواة عبر ثقوب النواة ليعمل كقالب لتكوين شريط DNA الآخر المتكامل معه بمبدأ A-T و C-G بإستخدام النيوكليوتيدات الحرة وإنزيم بلمرة DNA فى نواة خلية العائل ،

 ثم يندمج ويلتحم DNA الفيروسى الناتج مع DNA الخلية العائل ليتضاعف معه وبالتالى يتضاعف الفيروس حيث يتحول DNA الفيروس مرة أخرى إلى RNA ( وذلك لتكوين المادة الوراثية للفيروس ) ، كما تكون الخلية المصابه غطاء الفيروس وباقى مكوناته . 

الطريقة الأولى : باستخدام البلازميد أو الفاچ : ( النسخ داخل كائنات حية ) : 

-- يُعزل الجين أو قطعة DNA المراد إستنساخها بإحدى الطريقتين ( بإستخدام إنزيمات القصر – أو بإستخدام إنزيم النسخ العكسى ) .

-- يُعزل البلازميد من خلايا بكتيرية . 

-- يتم معاملة كلاً من الجين والبلازميد ( أو الجين و DNA الفاچ ) بنفس إنزيم القصر فيؤدى ذلك إلى : 

قطع كلاً من الجين المطلوب إكثاره والبلازميد فى موقع تعرف واحد وترك أطراف مفردة الشريط لاصقة متكاملة القواعد ومتممة لبعضها البعض ،

أو قطع كلاً من الجين و DNA للفاج فى موقع تعرف واحد وترك أطراف مفردة الشريط لاصقة متكاملة القواعد ومتممة لبعضها البعض . 

-- عند خلط قطع DNA ( أو الجين ) مع قطع البلازميد :

تتزاوج قواعد الأطراف اللاصقة لكل من الـ DNA والبلازميد بروابط هيدروجينية ، وكذلك عند خلط قطع DNA ( أو الجين ) مع DNA الفاچ تتزاوج قواعد الأطراف اللاصقة لكل من الـجين و DNA الفاچ بروابط هيدروجينية ويسمى DNA الناتج فى الحالتين بـ DNA معاد الإتحاد . 

-- يُستخدم إنزيم الربط لربط القطعتين معاً :

عن طريق تكوين روابط تساهمية بين هيكل السكر فوسفات لقطعة وهيكل السكر فوسفات للقطعة الأخرى ( يساعد ذلك الإنزيم على تكوين رابطة تساهمية بين مجموعة الفوسفات والهيدروكسيل فى نيوكليوتيدتين متجاورتين فى نهايتى قطعتين ) ، فبدون إستخدام هذا الإنزيم لاتكتمل العملية ولايزال شريطى السكر والفوسفات منفصلان . 

-- يُضاف البلازميد ( محتوياً على الجين أو قطعة الـ DNA المضافة إليه ) إلى :

مزرعة من الخلايا المضيفة كالبكتيريا أو خلايا الخميرة ( لإمتلاكها بلازميدات ) وبها وسط غذائى ملائم لنموها وتكاثرها ، أو يترك الفاچ ليهاجم خلايا بكتيرية وتلك الخلايا تم معاملتها مسبقاً بالحرارة وكلوريد الكالسيوم لزيادة نفاذيتها للـ DNA أو إلتقاطها للبلازميد . 

-- عند إنقسام وتكاثر تلك الخلايا البكتيرية بالإنشطار الثنائى وخلايا الخميرة بالتبرعم :

تتضاعف البلازميدات مع تضاعف المحتوى الجينى للخلايا البكتيرية ، وكذلك يسخر الفاچ الخلايا البكتيرية لمضاعفة مادته الوراثية وبالتالى تكاثره ، وبتلك الطريقة تقوم تلك الخلايا بإنتاج المواد المفيدة كالأنسولين بكميات إقتصادية . 

-- يتم تكسير الخلايا المضيفة ( بكتيريا أو خميرة ) وعزل وتحرير البلازميدات أو الفاچات :

  وذلك بعد الوصول إلى عدد معقول من الخلايا الموجود بداخلها البلازميدات أو الفاچات . 

-- تعامل البلازميدات أو DNA الفاچ بنفس إنزيم القصر الذى سبق إستخدامه فى البداية : 

 وذلك للفصل بين البلازميد والقطعة المراد إستنساخها حيث يتعرف على أماكن الإلتحام ويقطعها مرة ثانية  .

-- تُعزل الجينات ( أو قطع DNA ) عن البلازميدات أو الفاچ بالطرد المركزى المفرق . 

وبذلك يمكن الحصول على كمية كافية من الجين أو قطع DNA المتماثلة التى يمكن تحليلها لمعرفة تتابع النيوكليوتيدات بها أو زراعتها فى خلايا أخرى أو إستخدامها فى أى من تجارب الهندسة الوراثية . 

ملحوظة : 

♦ عملية عزل جين مفيد من مادة وراثية ( DNA ) لكائن وزرعها فى نوع آخر :

لإعطاءه صفة جديدة مثل إنتاج الأنسولين أو مقاومة الآفات الزراعية أو إنتاج الإنترفيرونات أو هرمون النمو تسمى بالهندسة الوراثية . 

♦ كلاً من البلازميد والفاچ يحتاج إلى خلايا حية لكى يتضاعف بها :

إلا أن الفاچات ( الفيروسات البكتيرية ) تقتل وتحلل الخلايا البكتيرية التى تتضاعف بها فتؤدى فى النهاية إلى مجموعة من الفاچات وليس من الخلايا البكتيرية . 

♦ الفرق بين DNA المهجن DNA معاد الإتحاد : 

-- المهجن : 

كل شريط من الشريطين بأكمله من مصدر مختلف ، ولا يستخدم فى إنتاجه أى إنزيمات ويتم فصل الروابط الهيدروجينية برفع درجة الحرارة ويتم تكوين الروابط مرة أخرى بالتبريد . 

-- معاد الإتحاد : 

جزء فقط من DNA من كائن حى لصق فى DNA لكائن حى آخر ، وتم إستخدام إنزيم القصر لقطع ذلك الجزء ( فصل الروابط التساهمية والهيدروجينية ) وإنزيم الربط للصق ذلك الجزء فى DNA آخر ( تكوين الروابط الروابط التساهمية والهيدروجينية ) . 

الطريقة الثانية : باستخدام جهاز تفاعل البلمرة التسلسلى PCR Polymerase Chain Reaction : ( النسخ داخل أنابيب إختبار ) : 

♢ إخترعه العالم كِيرى مُوليس عام 1985م وأخذ عليه جائزة نوبل . 

♢ يمكن إستخدامه لمضاعفة قطع DNA أو جين ما آلاف المرات 

صناعياً فى المختبر خارج الخلية فى دقائق معدودة لإستعمالها فى إجراء فحوصات عليه كمعرفة ترتيب القواعد النيتروجينية فيه أو تشخيص الأمراض الوراثية أو إستخدامه فى البحث الجنائى كتحديد هوية أو إثبات نسب مثلاً . 

♢ لمضاعفة تلك القطع يُستخدم إنزيم " تاك بوليميريز Taq polymerase "

 تم إستخراجه من نوع من البكتيريا تعيش فى المياه الحارة تسمى THERMUS AQUATICUS ، ويعمل هذا الإنزيم عند درجة حرارة مرتفعة فيتحمل الحرارة العالية جداً ولا تؤثر فى وظيفته ، ثم توضع نسخة من قطعة DNA المطلوب إستنساخها وتوضع كذلك كمية من القواعد النيتروجينية التى سيستخدمها الإنزيم فى ترتيب النيوكليوتيدات لتكوين وبناء النسخ المطلوبة . 

♢ يتم رفع درجة الحرارة لفصل شريطى قطعة الـ DNA عن بعضهما

 ثم تخفض درجة الحرارة مرة ثانية لبدأ تركيب شريط مكمل لكل شريط من الشريطين بإستخدام النيوكليوتيدات الحرة المضافة فى الأنبوبة ثم ترفع درجة الحرارة لفصل شريطى كل قطعة DNA من القطعتين الناتجين ثم تخفض لتكوين 4 قطع وهكذا حتى يتم تكوين النسخ المطلوبة . 

♢ قبل إكتشاف ذلك الإنزيم وإختراع هذا الجهاز 

لم تكن هناك طريقة لمضاعفة قطع DNA إلا فى الخلية وقت إنقسامها فقط ، الآن عملية إستنساخ وزيادة عدد قطعة أو جين من الـ DNA ممكن أن تتم خارج الخلية بسرعة عالية وبتحكم دقيق فى عدد النسخ المطلوبة . 

♢ يقوم إنزيم تاك بوليميريز فى الجهاز بعمل إنزيم بلمرة DNA فى جسم الكائن الحى
 إلا أن الأخير لايتحمل درجات الحرارة العالية . 

♢ يقوم الجهاز أولاً بفك إلتفاف الجزء المطلوب تضاعفه ثم يبدأ فى إضافة النيوكليوتيدات لتكوين شريط جديد يتكامل مع كل شريط قالب .

♢ من عيوب هذا الجهاز : 

عدم إصلاحه للأخطاء التى تحدث أثناء تضاعف القطعة من الـ DNA بعكس التضاعف داخل الخلية .

• شارك هذه المقالة